產品簡介:
?本產品采用獨特的疏水膜技術,徹底去除樣品中蛋白和DNA等干擾物,從而提取高純度的RNA。試劑盒采用獨特的緩沖系統(tǒng),可從多種不同類型的動植物組織、細胞中快速提取總RNA。本試劑盒提取得到的RNA純度較高,去除抑制下游反應的物質,避免因RNA不純引起實驗失敗。
組份
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BKM-RTQ-K50(50次)
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Mini Column
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50
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2 ml Collection Tube
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50
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Buffer KB (Column solution)
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30 ml
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Buffer KL (Lysis solution)
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50 ml(4 ℃保存)
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Buffer KRW (Wash solution)
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50 ml(4 ℃保存)
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Buffer KRE (RNA-elution solution )
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15 ml(4 ℃保存)
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Buffer KW1 (Wash solution 1)
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50 ml
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使用說明:
1. 實驗前準備工作:詳細閱讀該手冊熟悉各步驟,并準備好所有的試劑盒組分、1.5 ml和2 ml RNase-free滅菌離心管、75%乙醇、異丙醇、巰基乙醇以及65℃的溫浴條件。實驗過程中使用的離心管如未加說明,均為RNase-free滅菌離心管。
2. RNase酶是導致RNA降解最主要的物質,但是它廣泛存在于環(huán)境中,并且非常穩(wěn)定,常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌法和蛋白抑制劑都不能使其完全失活。因此,在進行與RNA制備有關的分子生物學實驗時,需嚴格遵守以下規(guī)范:
1)提取總RNA前,需提前處理實驗所用的器皿和儀器。移液器一般情況下可以用RNase-free水配制的75%乙醇擦洗移液器的內部和外部;研缽、研棒、藥匙、玻璃器皿等需在180 ℃烘干4 h以上;槍頭、離心管等塑料器皿需用RNase-free水配制的0.1%(v/v)DEPC水(DEPC具有致癌性,操作時需戴手套)浸泡12h后,再高壓蒸汽滅菌后使用;75%乙醇需用DEPC水配制。
2) 電泳槽等可以用0.2M 的NaOH 浸泡,并用純水漂洗?!?/p>
3)全程佩戴一次性手套,并且經常更換。RNase廣泛存在于人體皮膚上,佩戴一次性手套可以避免RNase的污染。
操作步驟:
(一)平衡吸附柱
1. 取一 Mini Column柱裝在一個2 ml收集管上(已備)。加入500μl Buffer KB平衡液至柱子內,室溫13000 rpm離心1 min,使平衡液完全流過柱子。棄收集管中的濾液,將空柱套回收集管內。
注意:柱子不平衡,將導致RNA產率和純度減少。
(二)樣品處理
2. 按每1 ml KL加10μl的比例將Beta-巰基乙醇加入到KL中,此溶液一個星期穩(wěn)定。(省略巰基乙醇在大部分情況下是可以的。)。
3. 組織破碎:可根據不同樣品選擇適合的方法
1)液氮研磨:按10-50 mg組織將組織直接放入研缽,加入少量液氮,迅速研磨,再加少量液氮,再研磨,如此三次,將樣品研成粉末。用藥匙迅速將樣品干粉轉入到1.5 ml離心管中。加入700-1000 μl 的KL,混勻2min.
2)直接研磨:對于新鮮植物組織,將組織直接放入研缽,按50 mg組織/1 ml比例將KL加入研體,直接在KL中將樣品研磨勻漿后,轉入一新的1.5 ml離心管(推薦)。
3)勻漿器法:將10-50 mg組織樣品放入預先裝有700-1000μl 的KL的離心管中,用電動勻漿器充分勻漿約1-2 min。注意:組織體積不能超過KL體積的10%,否則勻漿效果會不好。
4)從細胞中提取:對于貼壁細胞,按照10 cm2/1 KL ml比例加入KL,用移液器吹打數次,進行消化裂解;對于懸浮細胞可離心收集后,每5×106動物、植物或酵母細胞或者107細菌細胞加入1 ml KL進行裂解。
注意:1)液氮研磨法中,研磨和樣品轉移要動作迅速,保持樣品始終為凍干狀態(tài)。
2)直接研磨法中,可以在通風櫥中進行,避免巰基乙醇造成的惡臭味。
3)省略巰基乙醇在大部分情況下是可以的。
4. 將裂解液在4 ℃ 或室溫下13000 rpm 離心5min。
(三)吸附
5. 將上清液轉移至新的2ml離心管,加入等體積的70%的乙醇溶液,顛倒混勻。(注意,70%的乙醇溶液必須用DEPC 水現配現用,否則會導致RNA 降解)
6. 將混合液(包括可能的沉淀)轉至已平衡的吸附柱內,室溫或4 ℃ 13000rpm離心30 s,使液體完全流過柱子。保留柱,棄去收集管中的過濾液,將吸附柱重新放入收集管。
注意:如混合液體積過大,可分成數次上柱,每次上樣量不要超過700 μl。
- 把柱子重新裝入2ml收集管,加700μl Buffer KW1至柱子,室溫12000 rpm離心1min,棄去洗滌液。
- 把吸附柱裝入2ml收集管中,加700μl Buffer KRW至柱中,室溫或4℃, 13000 rpm離心1 min,保留柱,棄去收集管中的過濾液
9. 把吸附柱裝入2 ml收集管中,加700μl 的70%乙醇至柱中或4℃,13000 rpm離心1 min,保留柱,棄去收集管中的過濾液。(注意,70% 的乙醇溶液必須用DEPC的水現配現用,否則會導致RNA 降解)
10. 將柱子重新套回2 ml收集管內。4 ℃ 13000 rpm或最高轉速離心2 min以甩干柱子基質殘余的液體。
注意:此步驟不可省,否則將導致乙醇殘留于RNA中,影響后續(xù)反應。
(五)洗脫
11. 把柱子裝在一個新的1.5 ml離心管上,加入30-50 μl(室溫)的KRE到柱基質膜的中央,室溫放置2 min。4 ℃ 13 000 rpm離心1 min以洗脫RNA。
注意:1)小心加KRE到柱中吸附膜的中間部位,確保液體將膜全部覆蓋。
2)Karroten 不保證開啟的KRE會一直保持RNase-free 狀態(tài)??捎米约盒刨嚨腞Nase-free水代替KRE。
12. RNA應保存于-20 ℃,若長時間保存,應凍存于-70 ℃。
注意:提取的RNA應盡快進行后續(xù)實驗。
注意事項:
?如不慎接觸皮膚可立即用大量的洗滌劑和清水清洗。
?為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴 一次性手套操作。