產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本試劑盒一種即用型的Western blot相關(guān)總蛋白分析試劑, 可通過(guò)測(cè)量562 nm處的吸光度并與蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的吸光度-濃度曲線進(jìn)行比較, 快速測(cè)定總蛋白濃度. 蛋白質(zhì)定量過(guò)程可以在45分鐘內(nèi)完成。
使用說(shuō)明：
配制參考
?以50:1的比例混合BCA試劑A和BCA試劑B. 即將50 ml BCA試劑A與1 ml BCA試劑B混合.
注意: 使用以下公式確定所需工作試劑的總量. (標(biāo)準(zhǔn)品+待測(cè)樣品) x (重復(fù)次數(shù)) x (每個(gè)樣品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液總體積.
?按照表1配制新的標(biāo)準(zhǔn)品體系. (用0.9% NaCl或PBS稀釋白蛋白 (BSA) 標(biāo)準(zhǔn)液)
表1：白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品的制備
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Tube Number |
稀釋液體積 (μl) |
BSA體積 (μl) |
BSA終濃度 (μg/ml) |
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A |
0 μl |
900 μl of 2 mg/ml Stock |
2000 μg/ml |
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B |
100 μl |
300 μl of tube A |
1500 μg/ml |
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C |
300 μl |
300 μl of tube A |
1000 μg/ml |
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D |
200 μl |
200 μl of tube B |
750 μg/ml |
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E |
300 μl |
300 μl of tube C |
500 μg/ml |
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F |
300 μl |
300 μl of tube E |
250 μg/ml |
|
G |
300 μl |
300 μl of tube F |
125 μg/ml |
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H |
400 μl |
100 μl of tube G |
25 μg/ml |
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I |
300 μl |
0 |
0 (blank) |
?將0.1 ml的每種標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白質(zhì)樣品加入單獨(dú)的標(biāo)記試管中.
?在每個(gè)試管中加入2 ml BCA工作試劑并充分混合.
?在37°C下孵育30分鐘.
注意：增加孵育時(shí)間和溫度會(huì)增加每次測(cè)試的凈562 nm吸光度, 并同時(shí)降低試劑盒的最低檢測(cè)水平和測(cè)試范圍.
?將所有管子冷卻到室溫(RT) .
?將分光光度計(jì)的波長(zhǎng)設(shè)置為OD 562nm. 用水將儀器校準(zhǔn)為零. 隨后, 在10分鐘內(nèi)測(cè)量所有樣品的吸光度.
注意: 即使冷卻至室溫后, 色彩仍會(huì)繼續(xù)顯影. 但是, 如果所有吸光度測(cè)量均在10分鐘內(nèi)進(jìn)行, 則隨后在RT處的顯影太弱而不會(huì)產(chǎn)生明顯的誤差.
?從所有讀數(shù)中減去空白的OD562.
?繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線: OD562 (Y軸) vs BSA標(biāo)準(zhǔn)濃度 (X軸)。 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度.
微孔參考
?以50:1的比例混合BCA試劑A和BCA試劑B. 即將50 ml BCA試劑A與1 ml BCA試劑B混合.
注意: 使用以下公式確定所需工作試劑的總量. (標(biāo)準(zhǔn)品+待測(cè)樣品) x (重復(fù)次數(shù)) x (每個(gè)樣品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液總體積.
?按照表2配制新的標(biāo)準(zhǔn)品體系. (用0.9% NaCl或PBS稀釋白蛋白 (BSA) 標(biāo)準(zhǔn)液)
表2：白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品的制備
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Tube Number |
稀釋液體積(μl) |
BSA體積 (μl) |
BSA終濃度 (μg/ml) |
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A |
0 μl |
200 μl of 2 mg/ml Stock |
2000 μg/ml |
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B |
30 μl |
90 μl of tube A |
1500 μg/ml |
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C |
60 μl |
60 μl of tube A |
1000 μg/ml |
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D |
60 μl |
60 μl of tube B |
750 μg/ml |
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E |
60 μl |
60 μl of tube C |
500 μg/ml |
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F |
60 μl |
60 μl of tube E |
250 μg/ml |
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G |
60 μl |
60 μl of tube F |
125 μg/ml |
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H |
100 μl |
25 μl of tube G |
25 μg/ml |
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I |
60 μl |
0 |
0 (blank) |
?將25μl的每種標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白質(zhì)樣品添加到單獨(dú)的微孔板孔中。
?向每個(gè)孔中添加200μlBCA工作試劑并混合。
?密封板并在37°C下孵育30分鐘。
?將板冷卻至室溫(RT).
?在10分鐘內(nèi)在讀板器上測(cè)量562 nm的吸光度.
?從所有讀數(shù)中減去空白的OD562. 繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線: OD562 (在Y軸上) 對(duì)BSA標(biāo)準(zhǔn)濃度 (在X軸上). 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度.
注意事項(xiàng)
?如果將本試劑盒冷藏或存放在冷庫(kù)中, 則試劑A或試劑B中可能會(huì)形成沉淀物. 要溶解沉淀物, 請(qǐng)?jiān)?7°C下緩慢加熱溶液, 同時(shí)進(jìn)行混合或微波處理幾秒鐘. 如果試劑盒被細(xì)菌污染, 則將其丟棄.
?如果樣品中仍然存在還原性物質(zhì)或金屬螯合物而引起干擾, 建議使用Bradford分析試劑盒.
?建議一式兩份地測(cè)定不同濃度和樣品的標(biāo)準(zhǔn)液. 每種測(cè)定均應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
?徹底混合試劑A和試劑B后, 新形成的綠色濁度將消失. 它不會(huì)影響性能.
?使用分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度時(shí), 測(cè)定的樣品量將減少. 使用37°C的培養(yǎng)箱時(shí), 請(qǐng)防止水蒸發(fā)的影響.
?消除或最小化干擾物質(zhì)影響的幾種方法:
?通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾去除干擾物質(zhì).
?稀釋樣品，直到物質(zhì)不再干擾為止.
?由于高濃度的去污劑也會(huì)影響結(jié)果, 因此請(qǐng)用三氯乙酸 (TCA) 沉淀樣品中的蛋白質(zhì).
?避免使用包括還原性物質(zhì), 螯合劑, 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿在內(nèi)的物質(zhì), 因?yàn)榧词節(jié)舛群艿鸵矔?huì)干擾蛋白質(zhì)的估算.
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